复方中药圣愈汤治疗股骨头坏死机制的网络药理(2)

1.6 构建共同靶点的蛋白互作网络 将上述共同靶点导入STRING 数据库，选择物种为人，以最低要求互动得分(minimum required interaction score)0.7为筛选参数，得到圣愈汤治疗股骨头坏死的PPI 网络，在构建的PPI 网络中，节点的大小和颜色深浅反映自由度(Degree)值大小，边粗细反映组合分数(combine score)大小。导出“TSV”文件并运用Cytoscape 3.7.2 软件中Network Analyzer 工具分析网络中节点的度值，根据度值的排序确定核心靶点。

1.7 GO 富集分析与KEGG 富集分析利用DAVID 数据库( 6.8)对潜在靶点进行GO功能富集分析，研究圣愈汤治疗股骨头坏死生物功能；KEGG 富集分析潜在靶点的相关通路，研究圣愈汤治疗股骨头坏死的主要信号通路，P＜ 0.01 代表富集结果显著。最后利用R 语言绘制GO富集分析图及KEGG 富集分析气泡图。

1.8 分子对接验证 采用Autodock vina分子对接软件来验证网络药理学筛选结果。在上述步骤结果基础上，选择靶点数目较多的活性成分作为配体和PPI 网络关系图中度值排名前5 的靶蛋白作为受体进行分子对接。从PDB 数据库中查询以上靶蛋白的3D 结构。用PyMOL 1.7.2.1 软件进行预处理，移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子(如水分子)。从PubChem 数据库下载筛选出关键化合物结构，并基于MMFF94 力场对化合物的结构进行优化。使用AutodockTools软件对化合物进行可旋转键的搜寻与定义[9]；对DPE 蛋白结构通过多肽链缺失残基和末端残基修补、除去水分子、添加氢原子、添加电荷，并保存为PDBQT格式。以原配体所在位点为靶蛋白的活性口袋，分别进行靶蛋白与活性化合物的分子对接。如蛋白没有原配体，则以蛋白和dna 相互作用的残基构建活性口袋进行对接。得出结合自由能(ΔGbind，kJ/mol)，根据文献报道[10]，这里选取结合能≤-5.0 k J/mol 的活性成分作为验证“成分-靶点”的筛选依据。选取“1.5”项中度值最高化合物和“1.6”项度值最高靶点对接结合构象用于对接结合模式分析，并使用Pymol 进行作图。

1.9 主要观察指标 主要观察关键基因在KEGG 和GO 富集结果，关键基因与关键化合物分子对接结果。

2 结果 Results

2.1 活性化合物的筛选结果 通过TCMSP 数据库检索共收集得到圣愈汤的化学成分752 个，其中黄芪87 个，人 参190 个， 白 芍85 个， 熟 地76个，当归125 个，川芎189 个，再以OB ≥30%和DL ≥0.18 为活性成分筛选条件对752 个成分进行筛选，得到复方中共66 个活性化学成分，黄芪、人参、芍药、熟地、当归和川芎的活性成分分别为20，22，13，2，2 和7 个，其中白芍和黄芪有1 个交集化合物，白芍、黄芪和人参有1 个交集化合物，川芎和黄芪有1 个交集化合物，当归、白芍和人参有1 个交集化合物，熟地、当归和人参有1 个交集化合物，主要活性成分的基本信息见表2。

2.2 股骨头坏死相关靶点筛选结果 根据筛选条件，对GEO 芯片数据库的基因芯片的二次分析获得5 443 个差异表达基因，运用R 语言软件绘制股骨头坏死相关芯片的差异表达基因的火山图和股骨头坏死相关芯片的差异表达基因的聚类图见图1。这些基因可能与股骨头坏死的发生发展密切相关；通过GeneCards和OMIM 数据库收集对股骨头坏死有意义的靶点736 个；删除重复项后纳入6 045 个候选基因。

表2 ｜圣愈汤中潜在活性成分基本信息Table 2 ｜Basic information of potential active components inShengyuDecoction编号 ID 化学成分 生物口服利用度(%)类药性 来源64.77 0.38 白芍2 MOL001918 芍药苷元(paeoniflorgenone) 87.59 0.37 白芍3 MOL001919 (3S，5R，8R，9R，10S，14S)-3，17-dihydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-2，3，5，6，7，9-hexahydro-1Hcyclopenta[a]phenanthrene-15，16-dione 1 MOL001910 11alpha，12alpha-epoxy-3beta-23-dihydroxy-30-norolean-20-en-28，12beta-olide 43.56 0.53 白芍4 MOL001921 芍药新苷(Lactiflorin) 49.12 0.80 白芍5 MOL001924 芍药苷(paeoniflorin) 53.87 0.79 白芍6 MOL001925 芍药苷_qt(paeoniflorin_qt) 68.18 0.40 白芍7 MOL001928 芍药内酯苷_qt(albiflorin_qt) 66.64 0.33 白芍8 MOL001930 苯甲酰芍药甙(benzoyl paeoniflorin) 31.27 0.75 白芍9 MOL000211 丁子香萜(Mairin) 55.38 0.78 白芍、黄芪10 MOL000422 山奈酚(kaempferol) 41.88 0.24 白芍、黄芪、人参11 MOL000492 (+)-儿茶素((+)-catechin) 54.83 0.24 白芍12 MOL001494 亚油酸乙酯(Mandenol) 42.00 0.19 川芎13 MOL002135 MYRICANONE(Myricanone) 40.60 0.51 川芎14 MOL002140 川芎哚(Perlolyrine) 65.95 0.27 川芎15 MOL002151 洋川芎醌(senkyunone) 47.66 0.24 川芎16 MOL002157 萘呋内酯(wallichilide) 42.31 0.71 川芎17 MOL000359 谷甾醇(sitosterol) 36.91 0.75 熟地、川芎、白芍18 MOL000433 FA 68.96 0.71 川芎、黄芪19 MOL000358 β 谷甾醇(beta-sitosterol) 36.91 0.75 当归、白芍、人参20 MOL000449 豆甾醇(Stigmasterol) 43.83 0.76 熟地、当归、人参21 MOL000239 熊竹素(Jaranol) 50.83 0.29 黄芪22 MOL000296 三萜皂苷(hederagenin) 36.91 0.75 黄芪23 MOL000033 (3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10， 0.78 黄芪17-[(2R，5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol 24 MOL000354 异鼠李素(isorhamnetin) 49.6 0.31 黄芪25 MOL000371 3，9-di-O-methylnissolin 53.74 0.48 黄芪26 MOL000374 5'-hydroxyiso-muronulatol-2'，5'-di-O-glucoside 41.72 0.69 黄芪27 MOL000378 7-O-methylisomucronulatol 74.69 0.3 黄芪28 MOL000379 9，10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside 36.74 0.92 黄芪29 MOL000380 (6aR，11aR)-9，10-dimethoxy-6a，11a-dihydro-6Hbenzofurano[3，2-c]chromen-3-ol 64.26 0.42 黄芪30 MOL000387 联苯双酯(Bifendate) 31.10 0.67 黄芪31 MOL000392 芒柄花黄素(formononetin) 69.67 0.21 黄芪32 MOL000398 异黄烷酮(isoflavanone) 109.99 0.30 黄芪33 MOL000417 毛蕊异黄酮(Calycosin) 47.75 0.24 黄芪34 MOL000438 (3R)-3-(2-hydroxy-3，4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol 67.67 0.26 黄芪35 MOL000439 (isomucronulatol-7，2'-di-O-glucosiole) 49.28 0.62 黄芪36 MOL000442 1，7-Dihydroxy-3，9-dimethoxy pterocarpene 39.05 0.48 黄芪37 MOL000098 槲皮素(quercetin) 46.43 0.28 黄芪38 MOL002879 酞酸酯(Diop) 43.59 0.39 人参39 MOL003648 朝鲜槐英(Inermin) 65.83 0.54 人参40 MOL004492 菊黄质(Chrysanthemaxanthin) 38.72 0.58 人参41 MOL005308 阿朴天仙子碱(Aposiopolamine) 66.65 0.22 人参42 MOL005314 南蛇藤苄酰胺(Celabenzine) 101.88 0.49 人参43 MOL005317 脱氧三尖杉酯碱(Deoxyharringtonine) 39.27 0.81 人参44 MOL005318 石竹胺(Dianthramine) 40.45 0.20 人参45 MOL005320 花生四烯酸(arachidonate) 45.57 0.20 人参46 MOL005321 紫穗槐酮甲(Frutinone A) 65.90 0.34 人参47 MOL005344 人参皂苷 rh2(ginsenoside rh2) 36.32 0.56 人参48 MOL005348 人参皂苷 Rh4_qt(Ginsenoside Rh4_qt) 31.11 0.78 人参49 MOL005356 吉九里香碱(Girinimbine) 61.22 0.31 人参50 MOL005357 五味子酯乙(Gomisin B) 31.99 0.83 人参51 MOL005360 马尔肯久纳醇苯酯(malkangunin) 57.71 0.63 人参52 MOL005376 人参二醇(Panaxadiol) 33.09 0.79 人参53 MOL005384 苏齐内酯(suchilactone) 57.52 0.56 人参54 MOL005399 胡萝卜甙_qt(alexandrin_qt) 36.91 0.75 人参55 MOL005401 人参皂苷 Rg5_qt(ginsenoside Rg5_qt) 39.56 0.79 人参56 MOL000787 蓝堇碱 (Fumarine) 59.26 0.83 人参

文章来源：《现代中医药》 网址: http://www.xdzyyzz.cn/qikandaodu/2021/0301/408.html